비타민 B12(Cyanocobalamin(시아노코발아민))(제2법) HPLC-UV/PDA/FL

건강기능식품의 기준 및 규격 제4. 3-12-2 비타민 B12(제2법)

컬럼: [LC/UV, 표1] 전처리칼럼 Capcellpak MF C(안지름 4.6 mm, 길이 150 mm, 충전입자크기 5 μm), 농축칼럼 Capcellpak MG C(안지름 2.0 mm, 길이 35 mm, 충전입자크기 5 μm), 분석칼럼 Capcellpak UG C(안지름 1.5 mm, 길이 250 mm, 충전입자크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것 (육방전환밸브 컬럼스위칭 시스템). [LC-MS 대안, 표2] ACQUITY UPLC® BEH(안지름 2.1 mm, 길이 50 mm, 충전입자크기 1.7 μm) 또는 이와 동등한 것
이동상: [LC/UV, 표1] 전처리칼럼 : 5 mM 인산이수소칼륨(KH2PO4) 용액 / 분석칼럼 : 5 mM 인산이수소칼륨(KH2PO4) 용액 : 메탄올(MeOH) = 80 : 20. [LC-MS 대안, 표2] A : 20 mM 개미산암모늄, B : 아세토니트릴, 그라디언트(시간 분 / A% / B%) : 0/95/5 → 0.7/95/5 → 1.2/80/20 → 1.6/80/20 → 1.7/20/80 → 3.7/20/80 → 3.8/95/5 → 6.0/95/5
유속: [LC/UV] 전처리칼럼 500 μL/분, 분석칼럼 120 μL/분 / [LC-MS 대안] 0.4 mL/분
검출: 자외부흡광광도검출기(UV) 550 nm(최대 흡수파장). LC-MS(질량분석기)를 이용한 정량도 동등하게 허용
주입량: [LC/UV] 200 μL / [LC-MS 대안] 2 μL
컬럼온도: 35℃ (LC/UV·LC-MS 동일)
이온화: ESI, positive (LC-MS 대안 조건, 표2)

표준물질: Cyanocob(III)alamin(α-(5,6-Dimethylbenzimidazolyl)cyanocobamide, 분자량 1355.37, CAS No. 68-19-9). 5 mM 인산이수소칼륨용액에 녹여 표준원액 100 μg/mL, 증류수로 희석하여 표준용액. LC-MS 대안 조건 상세(표2): 이온화 ESI positive, Monitoring ion(m/z) 678(precursor ion) / 147, 359(fragment ion), Capillary Voltage 3.5 kV, Source Temp. 120℃, Desolvation Temp. 350℃. 전처리 ① 정제가 필요하지 않은 경우: 균질화 시료 약 0.5~1 g을 50 mL 갈색 부피플라스크에 취해 5 mM 인산이수소칼륨 용액 40 mL와 클로로포름 5 mL를 넣고 10분 초음파 추출 → 클로로포름 제거 → 정용 → 4,500 ×g 원심분리 → 0.45 μm 멤브레인 필터 여과. 전처리 ② 정제가 필요한 경우: 시료 0.1~1 g에 0.2 M 초산나트륨 용액(pH 4) 49.5 mL와 1% 시안화나트륨 0.5 mL를 넣고 10분 초음파 추출 → 100℃ 수욕 30분 → 냉각·여과(Whatman No.2) → 비타민 B12용 면역친화성 칼럼(immunoaffinity column)으로 정제(증류수 3 mL 활성화, 추출액 9 mL 부하, 증류수 3 mL씩 3회 세척, 공기 10 mL 배출, 메탄올 3 mL 용출) → 70℃ 질소 건고 → 증류수 1 mL에 재용해. 계산: 비타민 B12 함량(μg/100 g)은 시험용액 농도(ng/mL)·전량·희석배수·시료채취량으로 산출. 정량한계는 원문 미명시. 참고: 제1법(3-12-1)은 미생물학적 정량법(탁도법)으로 LC법이 아니다.

출처: 건강기능식품공전 · 식약처고시 제2026-43호 (시행 2026.6.11. 시행) · 원문 보기

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